| Resumé |
Depuis une décennie, l'ADN libre circulant (ADNlc), un des composants principaux de la biopsie liquide, fait l'objet de nombreuses investigations cliniques en tant qu'outil diagnostic non invasif dans diverses pathologies, incluant les cancers solides et les anomalies génétiques d'origine fœtale. En cas de cancer, une fraction de cet ADN, l'ADN tumoral circulant (ADNtc) portant les altérations génétiques et épigénétiques des cellules tumorales, est libéré dans la circulation sanguine. Appuyées par la démocratisation du séquençage nouvelle génération et de la PCR digitale en gouttes (PCRdg), de nombreuses applications potentielles de l'ADNtc sont apparues dont : 1) le suivi de l'évolution de la maladie dans le cas de cancers de stade avancés ; 2) l'adaptation de la thérapie selon la nature moléculaire de la tumeur ; 3) le dépistage la présence d'un cancer ; 4) la détection précoce de la résurgence d'une tumeur et 5) l'identification post-résection chirurgicale de la présence d'une maladie résiduelle minime. Cependant, l'implémentation de l'ADNtc dans le cadre du diagnostic de routine reste encore très limitée à ce jour. L'absence d'une ligne directrice pour bien cadrer son utilisation et le manque d'harmonisation des conditions pré-analytiques fait partie des principales causes. Un premier aspect des travaux, réalisés dans le cadre de cette thèse de doctorat, a porté sur la caractérisation du profil de fragmentation de l'ADNtc à travers le développement d'un test original basé sur la PCRdg. Nous avons confirmé que l'ADNlc circulerait sous forme de fragments plus courts chez des patients atteints de cancer que l'ADN circulant de sujets sains. Nous avons également montré que la méthode d'extraction de l'ADNlc peut influencer son profil de fragmentation. Cette conclusion met en évidence l'importance de bien contrôler le processus de purification de l'ADNlc. Un second volet de ce mémoire décrit le développement d'un test de PCRdg en multiplex permettant à la fois de quantifier dans un même puit de réaction 3 tailles de fragment (69 - 243 paires de bases (pbs) ; 243 - 399 pbs et > 399 pbs) et de discriminer le statut allélique mutationnel sur une séquence spécifique de l'ADN. L'essai a été développé pour cibler les gènes KRAS (exon 2 codon 12/13) et BRAF (exon 15 codon 600) et permet le calcul d'un index d'intégrité (ii). Nous avons montré que l'ii de l'ADNlc peut être utilisé comme un marqueur diagnostic potentiel chez les patients atteints d'un cancer métastatique du pancréas, du côlon et du mélanome. Une troisième partie de ce mémoire s'intéresse à l'évaluation des performances de deux tubes de collection commerciaux (LBgard® Blood Tubes et Cell-Free DNA BCT®) dédié aux analyses de biopsie liquide. Basé sur le test de PCRdg développé dans le précédent paragraphe, nous avons montré qu'après 7 et 10 jours de conservation des échantillons à température ambiante, les performances des 2 tubes en termes de stabilisation des échantillons sanguins sont identiques. De façon intéressante, nous avons observé que la quantité d'ADNlc global a diminué après stockage de 38% +/- 32% sur n = 22 échantillons. Un quatrième chapitre de ce mémoire regroupe les données d'un étude pilote préliminaire ayant pour objectif initial de mesurer l'influence du rythme circadien sur la libération de l'ADNlc. Ce protocole réunit 30 sujets non malades : 20 hommes prélevés 8 fois durant 24h et 10 femmes prélevées 1 fois. Les analyses quantitatives et d'intégrité de l'ADNlc ont mis en évidence que le rythme circadien n'a pas d'impact significatif sur sa libération. En conclusion, les travaux de cette thèse ont montré que la PCRdg offre une multitude d'applications dédiées à l'analyse de l'ADNlc incluant le développement de nouveaux biomarqueurs et le contrôle du processus pré-analytique, indispensable pour garantir un rendu de résultats biologiques fiables. |