| Resumé |
Le potentiel de dommages liés intrinsèquement à la transcription provient de différentes sources, parmi lesquelles les conflits entre transcription et réplication (CTR). Le processus de transcription est étroitement régulé, tant au niveau de l'initiation que de la terminaison, afin d'éviter les risques associés aux conflits avec d'autres processus liés à l'ADN. Néanmoins, de nombreux événements de transcription se produisent dans le génome alors qu'ils sont apparemment non fonctionnels, ce qui définit le concept de transcription omniprésente et souligne la nécessité pour la cellule de coordonner la transcription avec d'autres processus. Les CTR se produisent lors de la rencontre entre les machineries de transcription et de réplication, entraînant un blocage de la fourche de réplication et provoquant potentiellement des dommages à l'ADN. Les CTR sont liés à la formation de R-loops, qui sont des hétéroduplexes intermédiaires formés lorsque l'ARN naissant s'hybride à sa propre matrice d'ADN, extrudant ainsi une molécule d'ADN simple brin. Les R-loops ont à la fois des fonctions physiologiques en tant qu'intermédiaires de certains processus cellulaires et un effet génotoxique lorsque leur formation n'est pas programmée. De plus, ils sont un obstacle à la progression des fourches réplicatives, étant capables par eux-mêmes d'induire un blocage de la fourche. L'hélicase Sen1 (SETX chez l'homme), conservée au cours de l'évolution, joue un rôle important dans la limitation et la résolution des CTR. D'une part, en tant que composant du complexe Nrd1-Nab3-Sen1, Sen1 est un facteur essentiel de terminaison de la transcription, fonctionnant sur de milliers de gènes non codants (c'est-à-dire des transcrits cryptiques instables ou CUTs). D'autre part, il a été proposé que Sen1 empêche l'accumulation de R-loops en vertu de son activité de déroulement de l'ADN:ARN. Actuellement, les mécanismes spécifiques par lesquels Sen1 affecte les niveaux de R-loops et des CTR ne sont pas bien définis, et la plupart des expériences précédentes ont été réalisées avec des mutants de Sen1 qui affectent fortement aussi sa fonction de terminaison de la transcription. Notre travail porte sur la dissection du rôle de Sen1 dans la stabilité du génome, visant à séparer les fonctions de Sen1 dans la terminaison des gènes d'ARN non codant et au niveau des R-loops et des CTR. Dans le cadre d'un travail collaboratif, nous avons montré que Sen1 interagit directement avec le replisome et avons caractérisé un mutant (sen1-3) qui porte trois mutations ponctuelles qui abolissent la liaison de Sen1 au replisome, tout en laissant intacte sa capacité à terminer la transcription via la voie NNS. Il est important de noter que l'activité RNase H, apportée par l'une ou l'autre des deux enzymes RNase H de levure, est essentielle dans les cellules sen1-3, ce qui suggère que Sen1 joue un rôle au niveau du replisome qui pourrait être redondant ou concurrent à celui des RNases H. Ces facteurs sont des ribonucléases qui ont une fonction critique dans l'élimination des R-loops, grâce à leur capacité à reconnaître et à digérer les hybrides ADN:ARN. Par une approche génomique systématique, nous avons étudié le rôle de Sen1 et son lien avec les RNases H, révélant que Sen1 favorise l'élimination de l'ARN polymérase II à de nombreux endroits où se produisent des conflits avec la réplication ou d'autres processus. Nous avons également étudié le rôle des RNases H dans ces processus et l'impact des R-loops. A cette fin, nous avons développé une nouvelle méthode, H-CRAC, pour détecter les cibles RNaseH avec une résolution nucléotidique. Nous montrons que les signaux H-CRAC chevauchent de manière significative les cartes R-loop connues de résolution plus faible et nous apportons la preuve qu'au moins une fraction des R-loops peut être détectée par cette méthode. Nous proposons un modèle qui intègre les rôles des RNases H et Sen1 dans la résolution des CTR et sur d'autres sites de conflits. |