CEP290, Amaurose congénitale de Leber, Ciliopathie, Pléiotropie, Saut d'exon, « Basal exon skipping », « Nonsense-Associated altered splicing », Oligonucléotide antisens

CEP290 code une protéine centrosomale essentielle à la genèse et à la maintenance des cils vibratiles et primaires qui sont indispensables à la signalisation et au fonctionnement de multiples types cellulaires, dont les cellules photosensorielles de la rétine. Les mutations récessives causent un spectre de ciliopathies, allant d'une dystrophie rétinienne, l'amaurose congénitale de Leber type 10 (ACL10) à des formes multisystémiques très sévères, tel le syndrome de Meckel type 4 (MKS4). Un modèle, reposant sur l'abondance d'isoformes protéiques fonctionnelles inversement corrélée à la sévérité du phénotype, a été proposé pour rendre compte de cette pléiotropie. La mise en évidence de saut d'exon basal (basal exon skipping, BES) CEP290 et d'une localisation préférentielle des mutations responsables d'ACL10 dans les exons en phase a substantifié ce modèle. Dans ce contexte, mes travaux ont visé à comprendre les atteintes rétiniennes étonnamment modérées (EOSRD) comparativement à l'ACL10 d'individus porteurs de mutations bialléliques tronquantes. L'analyse ARN des fibroblastes de ces patients a révélé l'exclusion des exons mutants par BES, mais aussi par un mécanisme induit par la mutation (nonsense-associated altered splicing, NAS), sans altération du cadre de lecture. Ces mécanismes ont permis la production de protéines raccourcies mais fonctionnelles, comme l'ont montré les analyses ciliaires. La mise en lumière de la contribution du NAS, seul ou combiné au BES, dans la variabilité de l'expression clinique des mutations a enrichi le modèle de pléiotropie (Publications 1 et 2). Ce travail nous a conduits à considérer un saut d'exon ciblé pour rétablir un cadre ouvert de lecture et corriger les anomalies ciliaires liées à une mutation récurrente CEP290, c.4723A>T (p.Lys1575*; exon 36), responsable d'EOSRD et d'ACL10 chez deux individus homozygotes. Un saut spontané de l'exon 36 a été observé dans les fibroblastes de ces individus. Celui-ci, moindre dans les cellules du patient ACL10, a été accentué à l'aide d'un oligonucléotide antisens (AON) spécifique du site donneur d'épissage de l'exon, permettant l'amélioration des constantes ciliaires chez le patient ACL10 mais pas chez le patient EOSRD, démontrant le potentiel de l'approche thérapeutique mais sous conditions (Publication 3). Pour l'évaluer, nous avons créé deux modèles murins respectivement homozygotes pour une mutation non-sens dans l'exon 35 (36 humain) et pour la délétion de l'exon 35 ainsi qu'un modèle hétérozygote composite pour ces variants. La caractérisation des animaux a révélé des phénotypes respectivement équivalents à MKS4, EOSRD et ACL10. Des injections intravitréennes d'un AON pour promouvoir le saut de l'exon 35 ont débuté dans le modèle ACL10 avec pour objectif d'atteindre une EOSRD (Publication 4, en préparation). Enfin, le dernier volet de ma thèse a porté sur la cible thérapeutique majeure CEP290 : la mutation c.2991+1655A>G qui crée un site donneur d'épissage dans l'intron 26. La compétition avec le site consensus conduit à la transcription d'ARNm sauvage et d'ARNm mutant contenant un codon stop prématuré. L'utilisation d'un AON pour rediriger le spliceosome vers les sites consensus fait l'objet d'un essai clinique de phase 2/3 dont les résultats sont encourageants. Cependant, le phénotype ciliaire atténué des cas d'EOSRD par rapport à celui d'homozygotes c.2991+1655A>G nous a conduits à nous interroger sur une interférence de la protéine tronquée possiblement produite à partir de l'allèle mutant. Pour évaluer cette hypothèse, nous avons traité des fibroblastes de patients homozygotes par des AONs gapmers spécifiques du transcrit mutant, en vue de le dégrader. Nos résultats préliminaires ont révélé une restauration de la taille des cils consécutivement à la dégradation du transcrit mutant, ce qui pourrait promouvoir une stratégie thérapeutique combinant la restauration d'épissage à la dégradation du transcrit mutant (Publication 5, en préparation).