Argonaute, VIH-1, Latence, MicroARN, Transcription, Épissage, Séquençage pleine longueur

Lors de l'infection des lymphocytes T CD4+ par le Virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1), le provirus intégré dans le génome de la cellule hôte est activement transcrit en un ARN pré-messager (pré-ARNm). Celui-ci peut-être traduit en protéines, ou incorporé dans les nouvelles particules virales en tant qu'ARN génomique. Il peut aussi être épissé en plus d'une cinquantaine d'ARNm viraux qui seront traduits en protéines nécessaires à la réplication du virus. Dans certains cas, le provirus peut être intégré de façon silencieuse et constituer un réservoir viral insensible aux thérapies antivirales. Cependant, lors de l'arrêt des traitements ce provirus silencieux peut être réactivé. Comprendre les mécanismes impliqués dans le contrôle de l'expression du VIH-1 constitue donc un enjeu majeur. Ce contrôle peut se faire au niveau de la transcription, de l'épissage, de la stabilité ou de la traduction des ARNm viraux. Les protéines Argonaute (Ago), sont principalement connues pour être impliquées dans la régulation de l'expression des gènes via la voie d'interférence à ARN. Cette voie fait intervenir de petits ARN non codants, les microARN (miARN), qui sont maturés successivement par les protéines Drosha et Dicer. Dans le cytoplasme, les miARN sont ensuite pris en charge par une des quatre Ago humaines pour former le miRISC (miRNA Induced Silencing Complex) capable d'inhiber la traduction des ARNm cibles. Même si les mécanismes sont encore peu clairs, plusieurs études montrent également qu'Ago1 et Ago2 ont des rôles nucléaires, notamment dans la transcription et l'épissage des ARNm cellulaires. Le rôle des miARN dans la réplication du VIH-1 est sujet à controverse. Les travaux du laboratoire ont montré qu'Ago1 et Ago2 sont impliqués dans la production des ARN viraux multi-épissés et des particules virales infectieuses, mais indépendamment de la présence de miARN. L'objectif de ma thèse est de mieux caractériser les possibles rôles nucléaires des Ago sur l'expression du VIH-1. Ma thèse s'articule autour de deux axes : le premier est de déterminer l'implication de ces protéines dans l'expression du VIH-1 dans des modèles de cellules infectées de façon latente. En m'appuyant sur des techniques de cytométrie en flux et de qPCR, j'ai montré que la déplétion d'Ago1, comme celle de Drosha, entraine la réactivation du provirus latent, tandis que la déplétion d'Ago2 ou de Dicer n'a pas d'effet. La réactivation du provirus est corrélée à une augmentation des ARNm viraux mais n'affecte pas leur stabilité. Finalement, des expériences de capture des ARN naissants et d'immunoprécipitation de la chromatine suggèrent qu'Ago1 se lie à la chromatine et participe à la répression de la transcription du provirus intégré, indépendamment des miARN. Le second axe consiste à approfondir le rôle d'Ago1 et Ago2 dans la régulation de l'épissage des ARNm viraux. Dans ce but, j'ai participé à une étude permettant d'analyser la régulation du transcriptome viral par séquençage pleine longueur dans des lymphocytes T CD4+ infectés. En générant des lectures de plusieurs milliers de nucléotides de long, nous avons montré que cet essai permet d'identifier et de quantifier l'ensemble des transcrits viraux produits lors d'une infection, et de suivre la cascade des évènements d'épissage impliqués. Cet outil permettra de caractériser le rôle d'Ago1 et d'Ago2 sur l'ensemble du transcriptome viral dans des clones cellulaires invalidés pour l'expression de ces protéines. En conclusion, mes travaux de thèse permettent d'approfondir nos connaissances sur les fonctions nucléaires des Ago encore peu étudiées et sur les mécanismes de régulation de la transcription virale dans des modèles de latence.