Exosome, Ectosome, Endosome, Membrane plasmique, Tétraspanine, RUSH

Les vésicules extracellulaires (VEs) sont d'importants vecteurs des communications intercellulaires. Délimitées par une bicouche lipidique, elles transportent des lipides, protéines et acides nucléiques. Elles jouent divers rôles, en particulier dans le cancer où elles peuvent avoir des fonctions pro- et anti-tumorales. Ces observations apparemment contradictoires pourraient s'expliquer par l'existence de différents types de VEs avec des fonctions différentes, l'effet observé dépendant des proportions de ces types présents dans l'échantillon étudié. Il existe en effet plusieurs VEs d'origine intracellulaire différente. D'une part, les exosomes résultent de la formation dans les endosomes de vésicules intraluminales, qui sont sécrétées lors de la fusion des endosomes avec la membrane plasmique. D'autre part, les ectosomes sont formés directement par bourgeonnement de la membrane plasmique. Les méthodes classiques d'isolation des VEs, basées sur leur taille et leur densité, ne permettent pas de séparer totalement les exosomes et les ectosomes aux propriétés physiques proches. Il est nécessaire de mieux caractériser les mécanismes de biogénèse et de sécrétion des différents types de VEs d'origine tumorale, pour mieux définir les fonctions de chaque type et éventuellement inhiber ou activer spécifiquement leur sécrétion. Il est toutefois difficile avec nos connaissances actuelles de proposer un mécanisme réellement spécifique d'un seul type de VE. Pour identifier des sous-types de VEs sécrétés par les cellules HeLa, j'ai utilisé les marqueurs vésiculaires CD63 et CD9, qui sont respectivement localisés dans les endosomes et lysosomes et à la membrane plasmique. Nous avons observé trois types de VEs : CD63+ CD9-, CD63- CD9+ et CD63+ CD9+. Pour étudier la dynamique du trafic de CD63 et CD9 j'ai utilisé le système RUSH qui permet de synchroniser et de suivre le trafic de protéines. Par vidéo-microscopie et par des expériences de marquage de surface et d'internalisation d'anticorps, j'ai pu comparer le trafic intracellulaire depuis le réticulum endoplasmique, l'arrivée à la membrane plasmique et l'internalisation de CD63 et CD9. J'ai ainsi pu déterminer que ces protéines sont colocalisées transitoirement au cours de leur trafic au niveau de la membrane plasmique et dans des corps multivésiculaires. L'utilisation d'un mutant de CD63, CD63-YA, qui est adressé à la membrane plasmique et n'est pas internalisé dans les endosomes, a permis de montrer que CD63 peut être sécrété dans des VEs depuis la membrane plasmique. Une analyse protéomique des VEs CD63+, CD9+ ou CD63-YA+ a par la suite permis l'identification de marqueurs des exosomes ou des ectosomes et confirmé la sécrétion de CD63 en majorité dans des exosomes et de CD9 en majorité dans des ectosomes. Le mécanisme de sécrétion des VEs portant CD63, CD9 et les marqueurs identifiés par la protéomique a finalement été étudié par l'utilisation de drogues impactant les endosomes et par l'inhibition de l'expression de gènes par ARNsi. J'ai aussi montré que les VEs CD9+ sont mieux internalisées par les HeLas que les VEs CD63+, ce qui montre une potentielle fonction différente de ces deux types de VEs. En utilisant des techniques innovantes d'étude du trafic intracellulaire et d'analyse des VEs, j'ai donc pu identifier des populations de VEs d'origine cellulaire différente et des marqueurs permettant de les identifier. Ces méthodes pourraient être adaptées à d'autres types cellulaires et à d'autres marqueurs vésiculaires afin d'identifier des mécanismes spécifiques de sécrétion de différents types de VEs pouvant être communs à une majorité de types cellulaires.