Hydroxylamine, Nitroxyde, Radical, Sonde moléculaire, Activation enzymatique, Espèces réactives de l'oxygène, ERO, Superoxyde, Stress oxydant, Spectroscopie RPE, Imagerie RPE fonctionnelle

Les espèces réactives de l'oxygène (ERO) sont ubiquitaires dans tous les organismes aérobies. Elles jouent un rôle important dans la signalisation et l'homéostasie cellulaire et leur quantité est finement régulée. Une surproduction d'ERO entraîne un état délétère de stress oxydant, lié à de nombreuses conditions pathologiques. La détection et la cartographie non invasives du stress oxydant in vivo donnerait accès à des informations essentielles sur la progression de ces maladies et pourrait constituer une aide au diagnostic et au traitement. La résonance paramagnétique électronique (RPE), à la fois méthode de spectroscopie et d'imagerie, couplée à l'injection de sondes moléculaires, est une technique prometteuse à cet effet. Deux méthodologies sont utilisées dans la littérature pour obtenir une information sur le statut redox : la mesure porte soit sur la vitesse de disparition du signal d'un nitroxyde (radical aminoxyle), soit sur la vitesse et l'étendue de l'oxydation en nitroxyde d'une hydroxylamine diamagnétique libérée dans la cellule à partir de précurseurs possédant une protection sensible aux estérases. Il y a cependant deux limitations actuelles à l'utilisation de l'imagerie RPE in vivo : le manque de sensibilité et de rapidité des spectromètres et la faible stabilité métabolique des sondes nitroxydes. Dans cette thèse, nous nous sommes concentrés sur ce dernier point de blocage. Nous avons synthétisé une série de nitroxydes substitués par quatre groupes éthyle, caractérisé leurs propriétés spectroscopiques et évalué leur stabilité biologique. À cette occasion, nous avons développé une nouvelle voie de synthèse vers les nitroxydes dérivés de la 2,2,6,6-tétraéthylpipéridine et avons observé une métabolisation rapide et inattendue par les microsomes hépatiques de rat. Nous nous sommes ensuite concentrés sur le développement d'hydroxylamines protégées. La plateforme optimale, retenue pour la simplicité de sa synthèse, sa stabilité biologique et ses propriétés spectrales, est le nitroxyde dérivé d'un noyau isoindoline tétrasubstitué par des groupes éthyle. Le concept de la nouvelle sonde inclut deux fonctionnalités clivables par des estérases : la protection de l'hydroxylamine et un groupe qui constitue une charge masquée pour accroître la rétention intracellulaire. Une stratégie établie pour protéger les hydroxylamines est l'acétylation, mais dans le cas de nitroxydes tétraéthylés, nous avons observé que le groupe acyle ne peut pas être hydrolysé par l'enzyme à cause de l'encombrement stérique. Nous avons résolu ce problème en introduisant un nouveau type de protection innovant sur l'hydroxylamine tétraéthylée. La nouvelle sonde s'est révélée être sélectivement et efficacement déprotégée par les enzymes purifiées et par une préparation cytosolique. La rétention intracellulaire et la sensibilité de la sonde ont été testées sur trois types de cellules en culture et sur des homogénats de tissu cardiaque de rat. Nous avons montré sa capacité à détecter l'accroissement du stress oxydant dans les cellules vivantes, tandis que les résultats sur les échantillons de tissus ex vivo sont encore préliminaires. Ce travail exploratoire représente une première étape dans le développement d'une nouvelle génération de sondes hydroxylamines protégées qui conduisent à des radicaux nitroxydes stables dans l'objectif d'améliorer l'imagerie RPE du stress oxydant in vivo.