Characterization of the pathophysiological mechanisms associated with NEK8/NPHP9 mutations identified in patients with severe renal ciliopathies
Caractérisation des mécanismes physiopathologiques associés aux mutations NEK8 / NPHP9 identifiées chez des patients atteints de ciliopathies rénales sévères
par Grampa Valentina sous la direction de Saunier Sophie
Thèse de doctorat en Biologie cellulaire et moléculaire
École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité

Soutenue le Monday 21 September 2015 à Sorbonne Paris Cité

Sujets
  • Homéostasie
  • Maladies héréditaires
  • Physiopathologie
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Mots clés
NEK8/NPHP9, Cil primaire, Ciliopathies rénales, Voie de signalisation de Hippo
Resumé
Les ciliopathies sont un groupe de maladies génétiques multi-systémiques liées à un dysfonctionnement du cil primaire, une structure sensorielle présente à la surface des cellules qui régule des voies de signalisation clés au cours du développement et de l'homéostasie tissulaire. Afin d'identifier de nouveaux gènes responsables de ciliopathies développementales sévères, ~ 500 patients / fétus ont été analysés par une approche de séquençage à haut débit de l'exome ciblant > 1 200 gènes ciliaires ("ciliome"). Nous avons identifié huit nouvelles mutations dans le gène NEK8/NPHP9 chez cinq familles dont les syndromes se chevauchent. NEK8/NPHP9 code une protéine kinase de la famille des NIMA qui se localise au niveau du compartiment Inversine du cil primaire et agit comme un régulateur de la signalisation Hippo, une voie essentielle contrôlant la taille des organes. Nous montrons pour la première fois que les mutations du gène NEK8 sont associées à une agénésie rénale et une hypodysplasie. De plus, notre travail met en évidence une corrélation génotype/phénotype: les mutations "perte de fonction" de NEK8 conduisant à reins élargies et kystiques, des kystes pancréatiques et hépatique, alors que les mutations faux-sens de NEK8 causent une hypodysplasie/agénésie rénale associée à une cardiopathie et une paucité des canaux biliaires. La première partie de mon projet de thèse porte sur l'étude de l'impact des mutations faux-sens de NEK8 sur divers processus cellulaires et des voies de signalisation dépendantes de NEK8. Nous avons démontré un effet "gain de fonction" des mutations faux-sens de NEK8 puisqu'elles affectent la ciliogenèse et la composition du compartiment Inversine (localisation ciliaire de ANKS6). De plus, ces mutations altèrent la localisation nucléaire de YAP, le principal acteur de la voie Hippo, ainsi que l'expression des gènes cibles de YAP dans les fibroblastes de patients et dans la lignée cellulaire rénale (mIMCD3) invalidée pour NEK8. De même, nous avons montré une accumulation anormale de YAP nucléaire dans les reins polykystiques de la souris Jck, porteuse d'une mutation faux-sens de Nek8. Un déséquilibre de la voie Hippo serait donc à l'origine des défauts de morphogenèses épithéliales. En effet, les cellules mIMCD3 invalidées pour NEK8 forment en culture 3D des structures anormales et/ou des sphères élargies qui s'accompagnent d'une persistance du marquage nucléaire de YAP et Ki-67 et forment de grandes sphères par rapport aux cellules contrôles. Des défauts plus sévères ont été observés pour les cellules ré-exprimant les différents mutants de NEK8, confirmant la pathogénicité de ces mutations et leur effet "gain de fonction". Enfin, le traitement par la Vertéporfine, un inhibiteur spécifique de l'activité transcriptionnelle de YAP, améliore non seulement le phénotype des fibroblastes de patients et des cellules rénales invalidées pour NEK8 en culture 3D, mais également in vivo les anomalies observées chez les embryons de poisson zèbre dues à la surexpression de la forme NEK8 humaine, confirmant ainsi l'implication d'une dérégulation de YAP dans les mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, nous avons observé que les mutants de NEK8 s'accumulent de manière anormale au niveau de l'appareil de Golgi dans les fibroblastes de patients, et que cet appareil de Golgi apparait dispersé. Nos résultats montrent que le recrutement de NEK8 au Golgi est sensible à la Brefeldine A et dépendrait donc de ARF1, une petite GTPase impliquée dans le trafic de protéines entre les compartiments du Golgi et du réticulum endoplasmique. Nous avons démontré que NEK8 interagit et co-localise préférentiellement avec la forme d'ARF1 liée au GDP, suggérant pour NEK8 une possible fonction de facteur d'échange d'ARF1 à des sites spécifiques (appareil de Golgi, membranes, cil) afin de promouvoir le trafic vésiculaire de protéines telles que les protéine ciliaires. (...)