Mécanismes moléculaires impliqués dans la virulence et la réponse au stress chez Francisella tularensis
Molecular mechanisms involved in the virulence and the answer to the stress at Francisella tularensis
par Dieppedale Jennifer sous la direction de Charbit Alain
Thèse de doctorat en Infectiologie
École doctorale Génétique, Cellulaire, Immunologie, Infectiologie et Développement

Soutenue le Friday 28 September 2012 à Université Paris Descartes ( Paris 5 )

Sujets
  • Francisella tularensis
  • Stress oxydatif
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Mots clés
Francisella tularensis,Stress oxydatif
Resumé
Francisella tularensis, agent étiologique de la tularémie, classée parmi les bactéries pathogènes les plus infectieuses pour l'homme, possède une palette d'enzymes lui permettant de faire face au stress oxydatif, notamment à l'intérieur des macrophages, sa principale cible cellulaire. Nous nous sommes consacrés à l'étude d'un nouveau locus potentiellement impliqué dans la réponse au stress oxydatif chez F. tularensis LVS : le locus FTL_0200-FTL_0209. L'analyse in silico de ce locus révèle une homologie de la partie proximale avec le locus batL impliqué dans l'aérotolérance chez Bacteroides fragilis. D'une part, le premier gène du locus, FTL_0200, détermine une protéine chaperon putative ATPase AAA+ de la famille MoxR. D'autre part, les gènes FTL_0201 à FTL_0205 présentent des motifs protéiques de type facteur von Willebrand de type A (VWA) et tétratricopeptide (TPR), potentiellement impliqués dans la liaison d'ions métalliques et les interactions protéineprotéine. Or, les gènes déterminant des ATPases AAA+ de type MoxR sont très souvent retrouvés dans des loci codant pour des prot ines à domaines VWA et TPR. Enfin, les données expérimentales disponibles sur ce type de loci suggèrent que les protéines chaperons MoxR s'associeraient avec des protéines à motifs VWA et TPR pour former des complexes impliqués dans l'insertion de cofacteurs métalliques sur leurs cibles dédiées (enzymes ou autres). Ces observations nous ont conduit à étudier le rôle du gène FTL_0200 dans la virulence de F. tularensis, et sa participation à la réponse au stress. L'étude du mutant de délétion LVS!FTL_0200 démontre que le gène FTL_0200 joue un rôle majeur dans la survie intramacrophagique, ainsi que dans la virulence de F. tularensis dans le modèle murin; elle confirme également sa participation à la résistance au stress. Une analyse transcriptionnelle du locus nous a permis d'identifier le site d'initiation de sa transcription ; les régions -10 et -35 correspondent à un site de fixation pour le facteur alternatif "32, intervenant en conditions de stress. Des expériences d'étiquetage moléculaire (TAPtag) sur les protéines FTL_0200, FTL_0201 et FTL_0205 codées par le locus, ont été réalisées afin d'identifier leurs partenaires d'interaction, et démontrer l'association des protéines produites par le locus en un complexe multimérique. L'analyse des résultats obtenus par spectrométrie de masse montre une interaction de FTL_0200 avec FTL_0201, une interaction de FTL_0201 avec FTL_0205 et une interaction de FTL_0205 avec FTL_0207, suggérant l'association de ces protéines en un complexe multimérique. De plus, les trois protéines, plus particulièrement FTL_0205, semblent interagir avec des enzymes proches ou internes au cycle de Krebs : l'¿-cétoglutarate déshydrogénase (KGDH), la pyruvate déshydrogénase (PDH) et l'acétyl-CoA carboxylase (ACC). Une expérience de double hybride bactérien confirme partiellement ces résultats. La protéine FTL_0205, présentant beaucoup plus d'interactions que les deux autres protéines, le gène correspondant a été muté. Il présente une sensibilité très accrue au stress oxydatif ainsi qu'un défaut de multiplication dans la lignée de macrophages murins primaires issus de moelle osseuse, et une atténuation de virulence dans les souris. L'activité des trois enzymes métaboliques découvertes dans les expériences de TAP, a été mesurée chez les mutants FTL_0200 et FTL_0205, et comparée à celle de la souche sauvage. La KGDH et la PDH présentent une activité significativement diminuée chez les deux mutants, tandis que l'activité de l'ACC reste inchangée. Les enzymes du cycle de Krebs participent à la synthèse de certains acides aminés. Une expérience d'infection cellulaire, avec ajout de casaminoacides, chez le mutant FTL_0205 montre une restauration de sa virulence au niveau de celle de la souche sauvage.